各位童鞋，上一期我们解析了WB实验中仪器、耗材和试剂的选择，相信各位在实验过程中还有还会有遇到各种各样的小问题，今天为大家整理一些WB实验中的常见问题和处理方案。
一、样本制备
硬组织或样本量多应选择液氮研磨，样本量少为避免损失选择玻璃匀浆器。使用玻璃匀浆器时注意冰上研磨减少蛋白降解。
提取过程中加入EDTA等蛋白酶抑制剂，避开蛋白酶最适温度（斑马鱼等冷血动物组织蛋白酶），快速提取。
研磨后还需要超声破碎，由于核酸和脂类都能与蛋白质结合，形成大分子复合物，使电泳速度拖慢或蛋白无法进入浓缩胶。尤其是核蛋白提取时，超声破碎必不可少。
上样前BCA法测定样本浓度，计算上样量。在这里为大家提供一个小技巧：可以测量吸光度，将样品浓度调整一致后再上样。
二、凝胶电泳
选对凝胶，跑大分子蛋白时，我们推荐使用Tris-Acetate 凝胶。
目的蛋白大小与凝胶浓度成反比，蛋白分离范围越大需要凝胶浓度越低。
内参蛋白的选择应与目的蛋白分子量相差5kDa以上。
电泳后凝胶不易长时间放置在电泳装置内，应及时放入转膜液中固定防止蛋白扩散。
三、转膜
选择合适的膜，膜一般有PVDF膜或NC膜。跑大分子蛋白选择PVDF膜，孔径尺寸最常见的是0.2μm和0.45μm，大多数蛋白质都可用0.45μm膜转移。
转膜有半干转和湿转两种，半干转方便快捷但不适用于大分子蛋白。
一般转膜电流在200-300mA左右，转膜时间在30-60min，或15-20mA过夜。大分子蛋白转移时间慢，推荐350-400 mA转移90min或 4°C，40 mA，转印过夜。
四、常见问题
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